Thực hành Tế bào thực vật

1.1. Chuẩn bị

a. Dụng cụ

Kính hiển vi, Lam và lamen, Cốc có mỏ 100 ml, Lưỡi lam, Kim mũi mác, lưỡi lam mới, Ống nhỏ giọt, Giấy thấm, Kim mũi mác, Ống nhỏ giọt, Giấy thấm,

b. Hóa chất: nước cất, dung dịch Lugol

c. Mẫu vật

- Mẫu một số tinh bột

- Củ hành tím (Allium ascalonicum);

- Lá cây sò huyết (lẻ bạn) (Tradescantia spathacea hoặc Tradescantia discolor);

- Trái ớt chín (Capsium frutescens L);

- Cà rốt (Daucus carota L.).

1.2. Nội dung thực hành

1.2.1. Cấu tạo và nguyên tắc sử dụng kính hiển vi

1.2.1.1. Cấu tạo kính hiển vi

Kính hiển vi quang học bao gồm các bộ phận chính sau:

          - Chân kính: làm bằng kim loại giúp giữ thăng bằng cho kính

          - Thân kính: làm giá để gắn các bộ phận khác vào và để có thể cầm được khi di chuyển.

Hình 2.19. Hình cấu tạo kính hiển vi

           - Đinh ốc thứ cấp: là một đinh ốc lớn dùng để di chuyển bàn kính lên, xuống với khoảng cách lớn (nhìn thấy được sự di chuyển của bàn kính). Chỉ được sử dụng đinh ốc thứ cấp với vật kính 4X và vật kính 10X.

          - Đinh ốc vi cấp: là một đinh ốc nhỏ, nằm cạnh đinh ốc thứ cấp, dùng để di chuyển bàn kính với khoảng cách rất nhỏ điều chỉnh sự rõ nét của mẫu quan sát. Khi quan sát từ vật kính 40X, chỉ sử dụng đinh ốc vi cấp.

          - Ống kính: có dạng cầu, không di chuyển được; phía trên ống kính là một hoặc hai thị kính. Bên dưới ống kính mang đĩa xoay tròn (đĩa mang vật kính) có gắn các vật kính với độ phóng đại: 4X, 10X, 40X, 60X. Vật kính càng dài, độ phóng đại càng lớn.

          - Bàn kính: mang mẫu vật để quan sát, ở giữa bàn kính có một lỗ trong là nơi ánh sáng đi qua. Trên bàn kính có bộ phận kẹp vi mẫu. Một bộ đinh ốc dùng để di chuyển vi mẫu qua lại và tới, lui.

          - Quang tụ: nằm bên dưới bàn kính, ngay dưới lỗ tròn, đây là một bộ phận dùng để ngưng tụ ánh sáng được gắn liền với bộ phận chắn sáng bên dưới. Trên tụ quang có đinh ốc vừa làm nhiệm vụ cố định tụ quang vừa để nâng hoặc hạ tụ quang.

Nguồn sáng từ tụ quang có thể mở rộng hay hẹp từ cần chắn sáng. Dưới tụ quang là một bộ phận đèn chiếu sáng hoặc một gương có hai mặt (một mặt phẳng, một mặt lõm) để lấy ánh sáng phản chiếu từ đèn.

1.2.1.2. Cách sử dụng và giữ gìn kính hiển vi

a. Để kính ở vị thế nghỉ

Trước và sau khi sử dụng kính hiển vi, luôn để kính ở vị thế nghỉ như sau:

(1)   Hạ bàn kính xuống thấp tối đa.

(2)   Xoay vật kính về điểm mù (hoặc vật kính nhỏ nhất).

(3)   Lấy tiêu bản ra.

(4)   Hạ tụ quang thấp tối đa, đóng chắn sáng tối đa.

(5)   Vặn nhỏ bóng đèn trước khi tắt công tắc đèn rồi rút phích cắm điện ra.

(6)   Vệ sinh kính.

Lưu ý: Không được tắt đèn hay rút phích cắm điện đột ngột khi chưa vặn nhỏ bóng đèn.

b. Sử dụng kính hiển vi

Trước khi sử dụng kính hiển vi, phải lau chùi nhẹ tay bằng vải mềm nhất là những vị trí: trên mặt kính, dưới mặt kính, gương hay tụ quang,…

          Tuyệt đối không được tháo gỡ vật kính và thị kính.

          Đặt kính hơi lệch về phía tay trái người quan sát.

b1. Cách soi vật kính 10X

(1).      Mở nguồn sáng, kiểm tra cần chắn sáng ở tụ quang.

(2).      Để tiêu bản lên mâm kính, kẹp chặt lại.

(3).      Xoay nhẹ đĩa mang vật kính để vật kính 4X hoặc 10X về ngay quang trục đến lúc nghe tiếng “cắt” nhỏ thì dừng lại.

(4).      Nâng bàn kính lên tối đa, lúc này mắt nhìn ngang trên bàn kính

(5).      Điều chỉnh xe đẩy cho mẫu vật nằm ngay dưới vật kính

(6).      Mắt nhìn vào thị kính đồng thời tay vặn ốc thứ cấp hạ dần bàn kính xuống từ từ cho đến khi nào nhìn thấy ảnh của vật thì dừng lại

 

Lưu ý:

- Ở vật kính X10, tụ quang hạ xuống thấp tối đa, chắn sáng mở 1/4.

- Khi chưa nhìn thấy hình ảnh của vật thì tuyệt đối không được vặn ốc vi cấp.

- Sử dụng đinh ốc vi cấp để điều chỉnh ảnh rõ nét. Đinh ốc vi cấp chuyển động được cả 2 chiều, mỗi chiều có ít nhất 2 vòng. Nếu đinh ốc vi cấp bị kẹt cứng khi chưa quay đủ 2 vòng, phải quay đinh ốc vi cấp 2 vòng về hướng kia. Tuyệt đối không được ráng sức vặn đinh ốc khi đã kẹt.

- Khi sử dụng kính hiển vi, nên ấn nhẹ trên cần kính hiển vi để trục kính nghiêng về phía mình một góc 10 -150. Không nghiêng trục kính nhiều nữa vì các dung dịch dùng để quan sát sẽ chảy ướt bàn kính, các vật kính và mẫu vật bị khô rất khó quan sát.

- Không bao giờ đặt 2 lamelle lên trên 1 lame.

- Luôn giữ cho mặt trên của lamelle phải khô ráo.

b2. Cách soi vật kính 40X

Muốn soi ở vật kính 40X, phải soi rõ ở vật kính 10X trước. Sau khi nhìn thấy rõ ảnh của vật ở vật kính 10X, thực hiện các bước sau:

(1).  Xoay sang vật kính 40X.

(2).  Nâng tụ quang ½.

(3).  Mở chắn sáng ½.

(4).  Mắt nhìn vào thị kính, tay vặn ốc vi cấp cho đến khi nhìn thấy rõ ảnh của vật.

Lưu ý:

- Tuyệt đối không sử dụng ốc đại cấp ở vật kính 40X.

- Không được vặn vi cấp hơn 1 vòng.

- Khi không nhìn thấy hình ảnh của vật thì hạ bàn kính xuống tối đa và  trở về vật kính 10X để tìm ảnh lại.

c. Cách lấy tiêu bản ra khỏi kính

- Xoay đĩa mang vật kính về vật kính có độ phóng đại nhỏ (4X).

-  Mở bộ phận kẹp và lấy tiêu bản ra khỏi kính.

- Tắt nguồn điện, lau chùi và để yên khoảng 5 phút rồi bao kính lại.

d. Bảo quản kính hiển vi

- Trước và sau khi sử dụng đều phải vệ sinh kính:

+ Phần cơ học: lau bằng khăn mềm.

+ Phần quang học: lau bằng giấy lau kính chuyên dụng (Lưu ý: không sử dụng bất kỳ lọai giấy nào khác để lau vật kính).

- Sau khi sử dụng vật kính dầu thì phải lau vật kính ngay.

- Khi không sử dụng kính nữa thì để kính ở vị thế nghỉ, đậy lại bằng túi vải hoặc để trong tủ kín.

- Để kính ở nơi thoáng mát (tránh ẩm mốc).

- Cầm kính hiển vi bằng hai tay: một tay cầm thân kính, một tay đỡ đế kính, cất kính vào đúng vị trí trong phòng thí nghiệm.

1.2.2. Cách làm tiêu bản và soi một số hạt tinh bột

1.2.2.1. Các bước thực hiện

- Chuẩn bị dụng cụ: lam, lamelle

- Nhỏ 1-2 giọt nước cất vào giữa lam

- Lấy ít tinh bột bằng kim mũi mác cho vào giọt nước trên lam

- Nghiền bằng kim mũi mác cho các hạt tinh bột rời nhau.

- Đậy lamen sao cho các hạt tinh bột tản đều nhau và không đọng bọt khí.

- Lau khô tiêu bản bằng giấy thấm (nếu có nước tràn ra ngoài lamen)

1.2.2.2. Quan sát và vẽ hình

Quan sát lần lượt các mẫu hạt tinh bột, từ vật kính 10X đến vật kính 40X.

Hình 2.20. Hình ảnh một số mẫu hạt tinh bột

 1.2.3. Cách làm tiêu bản và vẽ hình tế bào thực vật

1.2.3.1. Cách cắt lát mỏng bằng tay

- Cắt khoanh cà rốt thành khoanh dày khoảng 2 cm dùng để làm thớt.

- Đặt cơ quan (rễ, thân, lá) lên “thớt”; giữ chặt cơ quan trên thớt giữa ngón tay cái và ngón trỏ của bàn tay trái hay ngược lại.

  - Tay phải cầm lưỡi lam mới đặt thẳng góc sát vào cơ quan, cắt xuống thành từng lát mỏng bằng cách kéo về phía mình từ trái sang phải.

Chú ý:

- Cơ quan trước khi cắt nên đặt trong nước để khỏi bị khô héo.

- Lát cắt càng mỏng càng tốt, khi cắt phải kéo lưỡi lam theo một chiều nhất định, tránh kéo lưỡi lam qua lại nhiều lần và phải cắt nhiều lát để dễ lựa chọn.

- Lát cắt phải luôn thẳng góc với trục cơ quan, vì thế khi cắt được vài lát, phải kiểm tra lại mặt cắt; nếu thấy xéo phải cắt bỏ phần xéo rồi mới tiếp tục cắt.

- Lát cắt phải cho ngay vào dung dịch thích hợp (nước, nước javel ...) bằng cách dùng kim mũi giáo gở nhẹ các lát cắt dính trên khoai lang hoặc trên lưỡi lam và cho vào dĩa đồng hồ đã để sẵn dung dịch.

- Mẫu vật có thể cắt ngang hay cắt dọc tùy theo yêu cầu quan sát.

* Vị trí cắt: Rễ cắt ở miền lông hút hoặc miền tăng trưởng; Thân cắt giữa 2 mấu; Lá cắt ngang vùng gân chính gần cuống lá, không cắt ở ngọn lá.

1.2.3.2. Phương pháp nhuộm kép

Nguyên tắc của phương pháp nhuộm hai màu

Khi vi phẫu được nhuộm bằng dung dịch phẩm nhuộm hai màu son phèn - lục iod (Carmin aluné - vert d’iod), son phèn sẽ nhuộm màu hồng vách tế bào bằng cellulose và lục iod nhuộm xanh vách tế bào tẩm mộc tố.

Cách thực hiện

Mẫu vật sau khi được cắt thành lát mỏng sẽ lần lượt ngâm vào các dung dịch sau:

-  Nước javel 15 phút để loại nội dung tế bào.

-  Rửa nước cho sạch javel (ít nhất 3, 4 lần).

- Ngâm vào acid acetic 5 phút để tiếp tục loại nội dung tế bào và làm sạch nước javel còn sót lại.

-  Rửa nước (ít nhất 3, 4 lần) cho đến khi không còn mùi acid acetic.

-  Nhuộm bằng phẩm nhuộm son phèn - lục iod 3 phút.

-  Rửa nước cho sạch phẩm nhuộm và giữ vi phẫu trong nước.

Chú ý:

Luôn luôn để vi phẫu trong dĩa kính đồng hồ, chỉ dùng ống nhỏ giọt để rửa và thay đổi nước hay dung dịch trong dĩa. Tuyệt đối không nên dùng kim nhọn đụng vào vi phẫu vì khi các vi phẫu bể sẽ khó quan sát (không còn thời gian để thực hiện nhuộm lại).

1.2.3.3. Cách làm tiêu bản vi phẫu

Dùng kim mũi mác lấy 1 vi phẫu đặt lên giọt nước sẵn có trên lame. Đậy lamen lại rồi quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 10X.

 
Hình 2.21. Cách đậy tiêu bản 

1.2.3.4. Phương pháp vẽ hình

a. Yêu cầu của hình vẽ

Sinh viên cần vẽ hình theo yêu cầu của mỗi bài thực tập, vừa quan sát dưới kính hiển vi vừa vẽ hình nên cần vẽ cho đúng kỹ thuật và phải tuân theo một số qui ước nhất định bắt buộc như sau:

- Chỉ vẽ những đặc điểm cần thiết của các vi mẫu quan sát trên tiêu bản theo yêu cầu. Không được vẽ theo sách hay tài liệu dùng trong thực tập.

- Hình vẽ phải đủ to, phù hợp với tỷ lệ kích thước của những chi tiết cần vẽ.

- Nét vẽ phải gọn, sắc, đủ đậm và rõ ràng; tránh dùng thước để vẽ.

- Đối với những nét vẽ đôi thì tuân theo quy ước: ánh sáng tới từ góc trên, bên trái của trang giấy chiếu xuống tạo với cạnh của trang giấy một góc 45o; nét vẽ sẽ đậm phía không có ánh sáng tới là ở phía trên và bên trái.

- Mỗi hình vẽ cần có lời chú thích chung và riêng cho từng phần, từng chi tiết. Chữ chú thích bằng viết chì đen; các đường chỉ dẫn thì kẻ ngang và song song và không được cắt chéo qua với nhau.

          b. Cách vẽ lược đồ

Khi vẽ lược đồ, cần tôn trọng tỷ lệ kích thước giữa các phần trong cơ quan và phải vẽ đúng theo các dấu quy ước đã định.

Hình 2.22. Các quy ước vẽ lược đồ

1.2.4. Thực hiện tiêu bản để quan sát sắc lạp

a. Cách thực hiện

Nhỏ sẵn lên giữa lame một giọt nước.

Lấy khoanh cà rốt làm thớt, dùng lưỡi lam cắt vỏ quả ớt thành từng lát mỏng, chọn một lát mỏng đều đặt trên mặt lame, đậy lại bằng lamelle.

b. Quan sát

Dưới vật kính 10X, trong các tế bào nhu mô hình đa giác của vỏ quả ớt có nhiều hạt nhỏ màu đỏ cam của sắc tố caroteniod, đó là các sắc lạp.

Dưới vật kính 40X, các lạp này có kích thước tương đối đồng đều nhau, có thể có hình thoi, hình hơi tròn tùy theo từng loại ớt

1.2.5. Thực hiện tiêu bản để quan sát tế bào thực vật

a. Cách thực hiện

- Nhỏ sẵn lên giữa lame một giọt Lugol

- Gỡ lớp biểu bì trong của vảy hành tím:

- Dùng lưỡi lam rạch nhẹ lên lớp biểu bì một hình vuông cạnh 0,3 x 0,5 cm.

- Bóp nhẹ theo mặt cong của vảy hành để lớp biểu bì trong bong ra khỏi lớp tế bào nhu mô bên dưới.

- Dùng kẹp gỡ nhẹ một gốc của miếng mẫu để tách lớp biểu bì ra

- Đặt mặt trong của lớp biểu bì tiếp xúc với giọt phẩm nhuộm trên lame

- Đậy lamelle lại

- Đặt một cạnh lamelle tiếp xúc với giọt phẩm nhuộm và nghiêng một gốc 45o.

- Dùng kim mũi giáo đỡ cạnh đối diện và hạ lamelle xuống từ từ (tránh bọt khí) cho đến khi lamelle nằm sát trên lame.

b. Quan sát

Ở vật kính 10X, tế bào biểu bì có hình đa giác dài, vách tế bào trong (không nhuộm màu với iodo Iodua), nhân có màu vàng sậm, chất tế bào dưới dạng lấm tấm màu vàng lợt hơn.

Ở vật kính 40X, tế bào to hơn, vách tế bào bằng cellulose dày, nhân thường nằm lệch về một bên, ngoài là màng nhân, bên trong chứa chất nhân và một hay vài hạch nhân chiết quang màu vàng đậm, chất tế bào lấm tấm bao quanh nhân và nằm sát màng tế bào. Trong chất tế bào có những khoảng trống nhỏ không ăn màu, đó là vị trí các thủy thể (không bào).

1.3. Yêu cầu phúc trình

1)  Thao tác sử dụng kính hiển vi quan sát tiêu bản ở vật kính 10X và 40X

2)  Thao tác thực hành làm tiêu bản (GV chấm điểm trực tiếp)

3)                 Vẽ và chú thích hình ảnh các mẫu hạt tinh bột ở vật kính 40X.

4) Vẽ và chú thích đầy đủ các chi tiết:

- Tế bào biểu bì vảy hành tây dưới vật kính 10X và dưới vật kính 40X.

- Tế bào biểu bì lá cây sò huyết dưới vật kính 10X và dưới vật kính 40X.

- Vài tế bào nhu mô ở vỏ quả ớt có chứa sắc lạp.